三花接骨散

摘要:研究三花接骨散对垂体促进鼠骨折愈合的机制。方法是将Wistar鼠分成不同的组,于手术胫骨骨折后,每日喂服2%三花接骨散悬液(0.5ml/100g体重),对照组服5%阿拉伯胶。分别于服药3、7、14及28天取出垂体观察其重量 ,用图象分析仪观察经免疫组化染色的垂体生长激素细胞面积和灰度。结果表明鼠体重及垂体重量实验组与对照组无明显差异。但生长激素细胞的面积和灰度与对照组有明显差异。除了三大组外,服三花接骨散的各实验组生长激素细胞的面积和生长激素的含量均增高。但此变化在骨折愈合后或停药后可以恢复到正常水平。由上述结果提示三花接骨散增加垂体生长激素细胞合成生长激素是其促进骨折愈合的机制之一。

   中药三花接骨散有促进骨折愈合作用,已为动物实验及临床实践所证实。本实验用现代医学研究手段来探索三花接骨散促进骨折愈合作用的机理。既往文献报道,骨折后垂体生长激素细胞机能有所改变,故本文着重研究大鼠骨折后,服用三花接骨散对垂体生长激素细胞的影响。

材料和方法
1、实验动物。Wistar雄性成年大鼠(首都医科大学动物科学部提供) 54只,体重220g~260g。每批12只,每6只一组,同组同笼饲养。室温18~24°C,颗粒鼠饲料,进食饮水不限。
2、实验分组。本实验分3天、7天、14天、28天四批进行,前三批共分两组, A组(实验组)为骨折后服三花接骨散组。B组(对照组)为骨折后服溶媒阿拉伯胶组。第四批28天则分为三组,除 A、B组外,C组为骨折后服药14天停药14天组,每组均为6只。
3、骨折模型制作。在5%水合氯醛(0.15ml /100g体重)腹腔麻醉下,备皮后经左胫前外侧做纵行切口,逐层切开分离暴露胫骨,在胫骨结节下1cm处,用薄锯横断,逐层缝合后,以石膏固定,7日后拆石膏。
4、喂药方法。三花接骨散溶于5%阿拉伯胶呈2%的均匀混悬液,按0.5m1/100g体重(药理实验学方法第二版“人与动物间按体表面积折算等效剂量比值表”计算)鼠灌胃器,每日灌喂一次。对照组按体重相应数量灌喂阿拉伯胶溶液。于骨折当日麻醉清醒后即行第一次喂药,连续至所定日期。
5、取材。按期测体重后断头处死大鼠,取血10m1,离心分离取血清做血清生长激素(GH)放免测定,试剂盒由美国NHPP提供。同时立即取垂体,用Bouin液固定,24小时后取出,用滤纸吸干,经1/100,000电子天秤称重。
6、垂体。GH细胞免疫组织化学染色方法Bouin固定之垂体,常规脱水,石蜡包埋,连续切片,厚度为5μm,每例取中部最大横切面进行GH细胞免疫组织化学染色。本实验用酶标金黄色葡萄球菌蛋白A(SPA)代替二抗进行间接法染色,具体步骤如下:
(1)烤片、60° C、2hr
(2)常规二甲苯脱蜡、20min×2
(3)梯度酒精水化
(4)3%过氧化氢-甲醇、20min除去内源性过氧化物酶活性
(5)DW清洗×2
(6)0. 01M、PBS液(PH7.4)、5min×1
(7)正常羊血清( 1∶10)37° C、30min封闭除、去外源性过氧化物酶
(8)滴加Ⅰ抗, 37℃湿盒内孵育1小时后4℃过夜。Ⅰ抗为猴抗鼠GH抗体(美国NHPP提供)最佳稀释度1∶200
(9)0. 01M、PBS液( PH7. 4) 5min×3
(10)滴加酶标金黄色葡萄球菌蛋白以(SPA)(上海科技生物所)代替Ⅱ抗,最佳释度为1:40、37°C小时
(11)0. 01M、PBS液( PH7. 4)5min×3
(12)0. 05M、Tris- Hc1缓冲液、(PH7.65min×1
(13)DAB显色
(14)中止反应,水洗,脱水,树胶封片、每例设阴性对照
7、垂体。GH细胞面积及细胞内GH含量灰度测定:每例在显微镜高倍镜(400×)下,随机取 20个细胞,用计算机图像分析,面积及灰度测试软件进行测试。以像素值计算细胞面积,以灰度级(32级)表明细胞内GH含量,灰度级值越低代表含量越高。
8、统计分析。所得各数据用PRIMER软件进行t检验、方差分析及Newman-Keuls(q检验)。

 


   由表1 t检验结果表明3天、7天、14天、28天各批实验中,体重、垂体重量各实验组(A)与对照组(B)比,均无显著性差异(P>0.05),垂体GH细胞面积,3天A组均数小于B组(P<0.05)有显著性差异。7天A组均数大于B组(P<0.05)有显著差异, 14天、28天, A、B两组均数相近,无显著性差(P>0.05)。

 

   血清GH含量3天、7天、28天A组与B组均数均无显著性差异,但3天A组还低于B组,而7天时A组已略高于B组,14天A组均数高于 B组有显著性差异(P<0.05)。
   垂体GH细胞GH含量灰度级比较,3天A组灰度高于B组均数有显著差异(P<0.05),7天、14天、28天A组灰度级均数低于B组,各组均数比较P<0.05,均有显著差异(灰度级越低表示细胞内GH含量越高)。


 

 

服药组与对照组相比细胞大小无明显差异 ,但 GH染色浓度明显深于对照组。

   为了检验服三花接骨散停药后,垂体GH细胞变化是否可复原,故骨折 28天实验组内另设骨折后服药 14天再停药 14天组(C),垂体GH细胞面积及灰度A、B、C三组进行方差分析及q检验。

结果
   各组大鼠外观无异常改变,垂体肉眼结构亦未见明显变化。A、B、C三组进行了两两比较,结果表明灰度级,B、C组与A组比较,分别均高于A组P<0.05有显著性差异,但 B、C两组比较无显著性差异。GH细胞面积比较,各组两两均无显著性差异。

讨论
   三花接骨散能加速骨折愈合己有定论。该药是中药复方制剂,因此促进骨折愈合的机理肯定是多因素的,本研究组在进行三花接骨散药效学实验过程中,发现它有增强生长激素作用的迹象,故本实验着重研究骨折后服用三花接骨散对垂体生长激素细胞的影响,以探索该药作用机理。
   众所周知,骨折发生后通过早期炎症反应、巨噬细胞清扫、即进入骨折愈合的重要阶段纤维性骨痂、原始性骨痂及继发性骨痂形成,最后完成骨折愈合。这个复杂的过程是受着多种因素调控。人体生长激素对骨生长及骨折愈合有以下作用:生长激素在肝内可刺激胰岛素样生长因子(IGF-Ⅰ及IGF-Ⅱ)形成,该因子可刺激间叶细胞增殖,形成成纤维细胞及肌纤维母细胞。同时GH是骨基质胶原形成的一种主要调节剂。肌纤维母细胞、成纤维细胞与各型胶原在骨折局部形成纤维性骨痂。此后在原发及继发性骨痂形成阶段中,起最关键作用的两种细胞-成骨及破骨细胞与GH亦有密切关系。
   成骨细胞能使骨折部位有足够的骨痂形成,以恢复骨的连续性和坚强度。成骨细胞膜上有高亲和力的Ⅰ型、Ⅱ型IGF受体, IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ可明显促进骨细胞的有丝分裂。影响骨细胞的分化,而在GH影响下肝内和骨内形成IGF-Ⅰ和IGF-Ⅱ。Kassem等通过组织培养结果提出GH对人体成骨细胞直接发挥合成代谢作用。同时GH通过改善肠钙吸收,并且能够兴奋肾脏1α-羟化酶活性,使25(OH)D3转换为1,25(OH)2D3,从而使1,25(OH)2D3浓度增高。而成骨细胞上有1,25(OH)2D3受体,它可影响成骨细胞的形态,增加成骨细胞的数目及刺激成骨细胞合成骨钙素的能力,增加骨量加速骨折愈合及加强骨的抗折强度。同时,1,25(OH)2D3在继发骨痂形成阶段,能刺激破骨细胞的前身单核巨噬细胞的分化及融合,影响破骨细胞的数目及活性。刺激骨吸收以恢复骨原来的形态.Bak-B等曾报导,动物实验己证实骨折后应用生长激素治疗,可增加骨折愈合负载。由此可见生长激素在促进骨折愈合过程中有极其重要的作用。
   早在60年代,陈奕权用垂体特殊染色观察兔骨折后垂体前叶组织学变化,提出家兔骨折后 3天垂体 GH细胞略有减少,随后逐渐增加,至14天达到最高峰,表现为细胞体积增大,分泌颗粒粗且多。第 17天后逐渐恢复正常。说明在骨折创伤修复一定期间内生长激素分泌细胞处于高机能状态。

   上述过程与本实验结果趋向是一致的。本实验用美国NHPP提供的鼠GH生长激素免疫试剂,特异性显示鼠垂体GH细胞。结果表明骨折后服用三花接骨散3天垂体细胞面积、灰度及血清GH均较对照组降低的更明显。但以后7天、14天、28天则回升均较对照组明显。血清GH值在 14天达最高峰与对照组比 P<0,05有高度显著性差异。细胞面积14天、28天开始回落与对照组相近,而表明细胞内GH含量的灰度级实验组一直高于对照组, P值均小于0.05。由此说明除骨折损伤及早期(3天)外,在开始修复期7天)以后,三花接骨散均有增加垂体GH分泌的作用,细胞形态学的变化(体积变大)维持的时间短于其机能变化( G H含量)的时间。但于骨折愈合第7至14日,GH的分泌是处于高峰阶段,此变化与既往病理组织学变化的结果是一致的,支持了三花接骨散可能通过增加GH促进骨折愈合,是其作用机理之一的论断。
   三花接骨散促进GH分泌的量是有限的,由本实验各批动物体重及垂体重,实验组与对照组均无明显差异可证实它不足以引起机体的异常增长。特别通过28天三组方差及q检验结果,亦说明当骨折后服药14天再停药14天后,垂体的变化水平基本恢复到对照组水平。由此可见三花接骨散是既有促进GH分泌增加,加速骨折愈合的作用。又不会导致垂体内分泌紊乱的一种比较安全的药物。